Hemofili A Hastalarında Regulatuvar T Hücre Fonksiyonlarının İnhibitör Gelişimine Etkileri: İmmün Tolerans Gelişiminde Sitokinlerin Etkisi

Abstract

Amaç: Hemofili A faktör VIII (FVIII) eksikliğine bağlı ortaya çıkan, X’e bağlı kalıtılan herediter bir hastalıktır. Günümüzde tedavide kullanılan plazma veya rekombinant FVIII (rFVIII) konsantrelerine bağlı en önemli sorunlar yarı ömrün kısa olması nedeniyle infüzyonların tekrarlanması gerekliliği ve hastaların %25-30‘unda FVIII’e karşı nötralize edici antikorların (inhibitör) varlığıdır. İnhibitör gelişiminde intron 22 inversiyonu, delesyon veya nonsense mutasyon gibi FVIII geninde oluşabilecek mutasyonlar bilinen önemli nedenlerdendir. Bunlar dışında major histokompatibilite (MHC)-II, interlökin (IL)-10 ve tümor nekroz faktör (TNF)-alfa gibi sitokinleri kodlayan regulatuvar genlerde oluşabilecek polimorfizm ve CTLA-4 reseptörü de etkili diğer faktörlerdir. Yapılan hayvan çalışmaları ile, CD4+CD25+ Thücreleri aracılığıyla FVIII‘e karşı tolerans geliştiği ve Treg (CD3+CD4+CD127-CD25+Foxp3+) hücrelerinin uzun süreli toleranstaki rolü gösterilmiştir.Bu çalışmada, inhibitör gelişmiş ve inhibitörü negatif Hemofili A hastalarında rFVIII ile uyarılmış CD4+CD25+ T hücre ile Treg hücre yüzdelerinin gösterilmesi; bu hücrelerden sekrete edilen TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-10, IL-13, TGF-beta sitokin düzeylerinin inhibitör gelişimi patogenezindeki rollerinin ortaya konulması, bu sayede de inhibitör pozitif hastalara uygulanacak spesifik immün tedaviye katkıda bulunulması amaçlanmaktadır.Yöntem: Çalışma grubu; (I) İnhibitör gelişmiş Hemofili A hastası (n=10), (II) İnhibitör negatif Hemofili A hastası (n=10), (III) hastalarla yaş ve cinsiyet uyumlu sağlıklı kontrol grubundan (n=10) oluşmaktadır. İnhibitör varlığı ve/veya düzeyi klasik Bethesda testi ile yapıldı. Periferik kan mononükleer hücre (PKMH) izolasyonu için; heparinli tüpe alınan 10 ml kan örneği 2 saat içinde laboratuvara ulaştırıldı. Kan örnekleri (1:1) steril PBS çözeltisi ile 2000 rpm’de oda ısısında 20dk santrifüj edilip PKMH ayrıldı ve zenginleştirilmiş RPMI kültür medyumunda 1x106PKMH/ml olacak şekilde süspanse edildi. Elde edilen PKMH; uyarılmamış, rFVIII ile uyarılmış ve fitohemaglutinin (PHA) ile uyarılmış (pozitif kontrol) olarak 120 saat kültüre edildi. Kültür sonrası süpernatantlar (600 µL) toplanarak -80°C’de saklandı ve ELISA yöntemi ile TNF-alfa, IFN-gama, IL-2, IL-10, IL-13, TGF-beta sitokin ölçümleri yapıldı. Süpernatantları toplanan hücreler, 0. gündeki gibi hücre yüzeyleri CD4, CD25, CD127 moleküllerine karşı florokrom işaretli monoklonal antikorlar ile işaretlendi ve hücre proliferasyonu flow sitometri cihazı ile incelendi. Sonuçlar % proliferasyon veya stimülasyon indeksi olarak değerlendirildi.Bulgular: Flow sitometri ile 0. günde CD4+CD25+ T hücre oranı; inhibitör(+) grupta %1.21±0.63, inhibitör(-) grupta %1.99±0.98, kontrol grubunda %0.54±0.18 bulundu. İnhibitör(+) grup, kontrol grubuna göre ve inhibitör(-) gruba göre anlamlı olarak farklılık gösterdi (p=0.003, 0.031). Treg hücre oranları ise inhibitör(+) grupta %14.27±4.46, inhibitör(-) grupta %14.85±8.95, kontrol grubunda %11.57±1.27 saptandı. İnhibitör(+) grubun Treg hücre düzeyleri, inhibitör(-) grup ve kontrol gruplarıyla anlamlı farklılık göstermedi. Sonuç: Çalışmada 3 koşulda gerçekleşen inkübasyon sonrası proliferasyon veri analizi ve hücre kültür süpernatantlarında sitokin düzeyi ölçümleri ileri tarihte yapılacaktır. Veriler tam elde edilememiş olmakla birlikte, gruplar arasında CD4+CD25+ T hücre düzeyleri arasındaki anlamlı faklılıklar, bu hücre grubu ve bu hücrelerden eksprese edilen sitokinlerin inhibitör gelişiminde rolü olabileceğine işaret etmektedir. Patogenezin aydınlatılması sayesinde bu hastalarda inhibitör gelişiminin önlenmesi ve alternatif tedavi olasılıkları ile yaşam kalitelerinin arttırılmasına katkıda bulunmaya çalışılacaktır.